?合成生物學是指對生物體進行有目標的設計、改造、重新合成，甚至創建并賦予其非自然功能的“人造生命”。無細胞合成生物學正在發展成為其中一種強大有效的手段，其目的是在不使用整個活細胞的情況下，理解、利用和擴展自然生物系統的功能。

無細胞蛋白質合成亦被稱為體外蛋白質，是一種用于補充基于細胞的蛋白質表達的技術，其合成系統無需完整的活細胞就可以在體外受控環境中模擬整個細胞的轉錄和翻譯過程，并允許對單個成分和反應網絡進行詳細深入的研究。

因此，無細胞蛋白質合成作為一種平臺技術，有望克服當前胞內生產系統中因為細胞膜約束帶來的表達局限性，在基礎科學研究和應用科學研究中具有廣闊的前景。

無細胞蛋白質合成系統概述

無細胞蛋白質合成（cell-free protein synthesis，CFPS）是無細胞合成生物學的技術核心，也被稱為體外蛋白質轉錄翻譯技術，該技術作為基礎和應用生物學的研究工具已經使用了近70年。

CFPS通過提取核糖體、氨酰-tRNA合成酶、翻譯起始和延伸因子、核糖體釋放因子等轉錄、翻譯、蛋白質折疊和能量代謝所必需的元素，并向其中添加DNA模板、能量和各種輔因子，模仿胞內環境以合成目標蛋白質。

CFPS系統最初是由Nirenberg和Matthaei在20世紀60年代開發的，在發現遺傳密碼方面發揮了重要作用。在過去的20年里，CFPS系統經歷了飛速的發展，以滿足對廉價和快速重組蛋白表達技術的日益增長的需求，這導致了眾多高活性CFPS平臺的發展。通過PubMed搜索關鍵詞“cell-free protein synthesis”分析1953—2020年公開論文發表數量，可以看到CFPS技術一直受到廣泛的使用和關注。

 

圖 | 每年CFPS論文發表數量（來源：CSCD）

CFPS之所以能夠飛速發展，主要是其具有快速表達具生物活性重組蛋白的潛力。具有這種潛力的主要原因是其相較于細胞體系的特有優勢。

首先，CFPS系統使用細胞提取物來模擬細胞內的環境，無需完整的活細胞且沒有細胞膜的限制，是一個開放的合成系統。

其次，系統中的所有物質與能量都可以用于生產感興趣的蛋白質，大大提高了蛋白質的表達效率。這些優勢克服了傳統的基于細胞的蛋白質合成系統的很多局限性。

此外，CFPS可以使用線性DNA作為表達模板，避免了基于質粒方法克隆步驟的耗時問題，使CFPS系統成為有潛力的高通量篩選工具。

 

圖 | 體內細胞和體外無細胞蛋白質合成比較（來源：CSCD）

隨著CFPS的快速發展，CFPS系統類型已經多種多樣。一類是提取物系統，根據細胞的提取物類型可分為高使用率模式細胞類型和低使用率非模式細胞類型。高使用率模式細胞類型主要包括大腸桿菌、酵母、小麥胚芽、昆蟲、中國倉鼠卵巢和兔網織紅細胞等。

無細胞人工“生命體系”構建中的應用和研究進展

為合成具有新的特性、結構和功能的蛋白質，應在CFPS體系中加入編碼該蛋白的DNA或mRNA模板，以及氨基酸和核苷酸等來啟動轉錄和翻譯過程。CFPS系統利用微生物、植物或動物細胞的粗提物產生核糖體、氨酰-tRNA合成酶、翻譯起始和延伸因子、核糖體釋放因子等轉錄、翻譯、蛋白質折疊和能量代謝所必需的元素。

傳統的無細胞反應模式包括兩類：批式反應和連續交換反應系統。批式反應裝置簡單，較易實現，所有的無細胞反應組分添加到一個試管中，可以快速合成目標蛋白質。然而，這種反應模式存在局限性，能量和氨基酸的消耗以及副產物的積累，特別是副產物對體外轉錄/翻譯有抑制作用，使得產率低下。為克服該缺點，科學家設計了連續交換無細胞反應系統。

 

圖 | 無細胞蛋白合成過程（來源：CSCD）

CFPS技術已實現了廉價且快速的重組蛋白質表達，其靈活性、可控性以及操作便捷等優勢迅速擴大其用途并逐步商業化。目前，各種原核和真核生物的無細胞平臺已經投入使用。

以人工生命體系的構建為例，主要有分兩步，一是噬菌體的合成；二是人工細胞的構筑。

噬菌體的合成：由于噬菌體對宿主的極端特異性，以及顯示出作為抗菌劑和細菌診斷的巨大醫學潛力，噬菌體目前已經廣泛應用于抗菌劑的研發、細菌診斷、疫苗研發、噬菌體聚合酶的合成以及用作遺傳可編程生物材料的支架等多個方面，并且在定向進化研究中發揮重要作用。然而，大多數噬菌體的基因組太大（>20 kb），很難在體外進行操作，而且對細菌宿主是致命的；體外轉錄翻譯無細胞表達系統，為噬菌體的合成和改造提供了更精確控制的可能性。

人工細胞的構筑：構建具有生命基本特征的人工細胞是合成生物學領域的一大挑戰，至今對其仍然沒有一個明確的定義。盡管生命系統具有高度的內在復雜性，但一般認為具備5個共同特征：區室化、生長分裂、信息處理、能量轉導和適應性。利用分子生物學工具和方法，自下而上將功能分子組裝成人工細胞，雖可實現基本的生命特征，但在實現自組裝、自我繁殖等方面面臨重大挑戰。目前大量利用無細胞轉錄翻譯系統模擬細胞結構和特征的工作已經開展，如分子擁擠、區室化、基因噪聲、網絡、動態行為和細胞通訊，致力于構建更“完美”的人工細胞。

 

圖 | 人工細胞的構建（來源：CSCD）

脂質體因其良好的生物相容性、生物可降解性、易制備和高包封性等特點［148］，最常用來構筑人工細胞。

在區室化構筑的研究中，研究最多的是基于囊泡和人工制備脂質體的人工細胞，脂質囊泡可以高效地包裹無細胞系統實現蛋白質的表達，從而形成高效可控的人工細胞系統。此外，微流控技術可以通過調整流速和通道尺寸精確控制液滴大小和形狀，在人工細胞構筑方面受到越來越多的關注。

細胞通訊或信息傳遞作為生命體系的重要特征，亦是人工細胞構建的主要目標之一，通常通過物理或化學信號遞送來實現。

隨著基于無細胞轉錄翻譯系統的人工細胞的發展，從進化生物學基礎研究到生物醫療應用研究都得到廣泛拓展。該團隊通過使用基于磷脂的囊泡展示了原始細胞的生長-分裂機制；人工細胞的發展還推動了無細胞生物傳感的研究；在醫學領域，可將人工細胞構筑用于藥物篩選。

然而，要真正實現“完美”人工細胞的構建，還需要實現自我復制、新陳代謝和信息處理等復雜功能，這仍然需要未來在相關領域的進一步拓展。

無細胞蛋白質合成系統機遇和挑戰

綜上所述，無細胞蛋白質合成系統作為一種強大的合成生物學技術平臺，因其開放性、可控性、高效性、靈活性等諸多優點，在過去5～10年時間里得到了多樣化的大力發展，其應用跨越了生物制造、生物催化、生物醫藥、生物傳感、人工細胞等重要基礎和應用研究領域。各種不同的CFPS技術平臺進一步使具有不同復雜性和物種來源的蛋白質的體外生產成為可能。

然而，無細胞蛋白質合成系統的發展中，仍然面臨諸多挑戰。

規模化和成本是工業制造中的兩大關注點。該系統的進一步發展需要無細胞蛋白質生產系統規模的擴大。一些難合成蛋白質的生產離不開動物和昆蟲細胞提取物，而這些提取物的制備較為繁瑣，有些耗時較長，是擴大工業化生產有待解決的一大問題。

與此同時，一些應用的發展常常受到試劑費用的限制。例如，在大腸桿菌CFPS系統中，如果以質粒為表達模板，以葡萄糖為供能系統，合成非天然綠色熒光蛋白每100 μg的總成本為0.658美元。為進一步提高產量、擴大生產規模，可從以下幾個方面尋求解決策略：簡化提取物制備程序、開發蛋白質合成的新能源再生系統、穩定底物供應和制備高效的正交翻譯系統。

在未來的發展中，無細胞體系需要進一步優化以提高效率、降低成本，同時提高生物大分子（RNA和蛋白質）合成的個性化、多樣化、普適性和穩定性；無細胞系統的使用壽命需進一步延長，需要朝著能夠實現自我復制的無細胞合成系統邁進；需要進一步融合先進材料學、人工智能和生物醫學等多學科領域，展現出無細胞合成系統更廣泛的應用潛力。

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