源起基金關(guān)注領(lǐng)域——類器官行業(yè)（二）
四、類器官的培養(yǎng)
除了成體干細(xì)胞，多能干細(xì)胞也可以利用其自我更新及分化能力來制備類器官。由于從多能干細(xì)胞中提取的類器官是通過同質(zhì)群體定向分化而形成的，因此必須在一個喚醒胚胎發(fā)生的動態(tài)過程中重新創(chuàng)造組織特異性細(xì)胞類型及其微環(huán)境。
因此，多能干細(xì)胞類器官培養(yǎng)必須在分化過程中提供合適的生態(tài)位信號。由于這一過程較復(fù)雜，多能干細(xì)胞類器官往往含有不同于模型器官的細(xì)胞類型，使靶組織的信號環(huán)境和自組織復(fù)雜化。
（一）培養(yǎng)流程和條件
類器官的培養(yǎng)從獲取組織樣本開始，經(jīng)歷冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室、自動化儀器解離細(xì)胞、類器官培養(yǎng)、類器官鑒定等環(huán)節(jié)，得到高質(zhì)量類器官。類器官的形成和成熟是在單細(xì)胞或小細(xì)胞簇擴(kuò)展和重組之前進(jìn)行的。
類器官培養(yǎng)首先要分離出胚胎或多能干細(xì)胞，然后將其培養(yǎng)在一個支持介質(zhì)上，進(jìn)行三維生長。介導(dǎo)類器官形成的信號通路與體內(nèi)器官發(fā)育與穩(wěn)態(tài)維持的信號通路相同，在培養(yǎng)過程中需要添加各種細(xì)胞因子，以激活或抑制參與類器官形成的信號通路。制備不同類器官需要使用不同細(xì)胞因子組合。已經(jīng)開發(fā)了各種工作流程來生成類器官，特殊類器官需要獨(dú)特培養(yǎng)方法，并不是所有通用工作流程都適用。
培養(yǎng)流程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是樣本制備和細(xì)胞培養(yǎng)條件控制及生長因子的選擇。類器官建立基本流程如下：首先獲得組織，組織類型主要包括正常組織、腫瘤組織和活檢組織。
針對手術(shù)切除的組織在消化解離前需要先剔除沒用的部分，也就是脂肪和肌肉組織。剔除之后進(jìn)一步進(jìn)行消化解離，取一部分保存進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，剩余部分包裹在基質(zhì)膠中，然后滴注到培養(yǎng)板上形成PDO，生長到一定程度之后進(jìn)行傳代和藥敏實(shí)驗(yàn)。
圖|從原生組織培養(yǎng)口腔黏膜類器官的過程
類器官培養(yǎng)試劑主要包括消化液、基質(zhì)膠(Matrigel等)、維持類器官生態(tài)所需因子和分化所需因子這幾個主要元素。基質(zhì)膠中含有膠原、巢蛋白和纖連蛋白等等，為類器官形成三維空間結(jié)構(gòu)提供基質(zhì)。維持類器官生態(tài)因子主要目的為促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡等。
這些試劑在不同實(shí)驗(yàn)室、公司以及培養(yǎng)不同種類的類器官之間差異性較大。類器官作為新型藥篩模型，成本雖然較PDX更低，但還是遠(yuǎn)高于細(xì)胞系，成本占比較高的包括基質(zhì)膠和細(xì)胞因子。
1.樣本來源
類器官建立成功與否很大程度上取決于取到的組織標(biāo)本，新鮮組織還有豐富上皮組織的樣本更容易培養(yǎng)出PDO，所以要把前期工作做好，樣本保持在4℃ DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并添加10μM的Y-27632能夠更好地保持細(xì)胞活性。
2.培養(yǎng)基
類器官的構(gòu)建依賴于3D培養(yǎng)環(huán)境，其中懸浮的培養(yǎng)基品質(zhì)是關(guān)鍵，一類是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，一類是另外添加的各種因子。最常用的培養(yǎng)基是基底膜提取物/基質(zhì)膠(BME)，BME包含多種組分如膠原蛋白IV、層粘連蛋白等，對于維持干細(xì)胞或前體細(xì)胞未分化狀態(tài)有重要作用，并不是單純提供一種固態(tài)支持的作用。在某些情況下，類器官可以在沒有細(xì)胞外基質(zhì)的情況下成功培養(yǎng)，例如乳腺腫瘤生長和分化的乳腺細(xì)胞系。
3.生長因子
生長因子是類器官培養(yǎng)基的重要組成部分，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^一系列信號通路組合的操作來指導(dǎo)干細(xì)胞的分化，這些信號通路可以生成和維持特定的類器官類型。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基之外的生長因子會隨著腫瘤類型的不同而發(fā)生變化，但基本上都會包含著四類因子：Wnt信號通路激活劑；酪氨酸受體激酶的配體，刺激上皮細(xì)胞增殖；TGF-β信號通路抑制劑，抑制上皮細(xì)胞分化；ROCK抑制劑，保持干細(xì)胞多能性。
圖|類器官生產(chǎn)中的生長因子和小分子抑制劑及其作用
4.基質(zhì)膠
基質(zhì)膜是特定細(xì)胞外基質(zhì)，在內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌肉或神經(jīng)細(xì)胞間形成界面，不僅可以支持細(xì)胞層，還在組織形成中影響細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化。
全球領(lǐng)先的基質(zhì)膠/基底膜提取物，提取于Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤，在37℃重新形成基底膜，其主要成分是膠原蛋白IV、層粘連蛋白等，還包含生長因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF等，主要用于支持細(xì)胞生長和分化，也用于細(xì)胞粘附、血管新生、提取外細(xì)胞遷移/侵襲和體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)等。對于維持干細(xì)胞或前體細(xì)胞未分化狀態(tài)有重要作用，并不是單純提供一種固態(tài)支持的作用。
（二）人源腫瘤類器官PDO的培養(yǎng)方法
PDO的樣本來源通常為腫瘤組織或者胸腹水等惡性積液，主流培養(yǎng)方法包括較為常用的正置膠滴法、適用于腫瘤和睪丸類器官培養(yǎng)的倒置膠滴法、適用于有氣體接觸的黏膜類器官(腸、呼吸道)培養(yǎng)的氣液界面法以及需要較大擴(kuò)增(腦類器官)的生物反應(yīng)器法等。
首先將患者來源的腫瘤樣本組織通過機(jī)械剪切得到腫瘤細(xì)胞團(tuán)，再將細(xì)胞團(tuán)酶消化成單細(xì)胞。分離消化后，將細(xì)胞嵌入到基質(zhì)膠中并在96/384孔板上進(jìn)行膠滴的種接，再覆蓋以培養(yǎng)基和細(xì)胞因子培養(yǎng)。類器官培養(yǎng)至直徑幾百微米的細(xì)胞小球即可用于藥篩。
正置膠滴法是較為常用的類器官培養(yǎng)方法，倒置膠滴法又叫懸滴法，是近年來細(xì)胞三維培養(yǎng)的一種，操作簡便，可以在懸浮狀態(tài)下自發(fā)成球。
懸滴細(xì)胞培養(yǎng)方法是通過將單細(xì)胞懸液形成一個個獨(dú)立懸滴，細(xì)胞在懸滴內(nèi)聚集成細(xì)胞球。氣液界面培養(yǎng)被認(rèn)為是呼吸系統(tǒng)生理學(xué)高度相關(guān)的培養(yǎng)體系，能夠克服2D培養(yǎng)的許多挑戰(zhàn)。
生物反應(yīng)器法是以生物反應(yīng)器為核心，通過懸浮或者支架貼壁的方式在生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建3D培養(yǎng)環(huán)境，采用工程技術(shù)手段對生物反應(yīng)器內(nèi)的環(huán)境參數(shù)如溫度、pH值及溶解氧濃度等實(shí)時在線測控，并輔以循環(huán)灌注的手段，加強(qiáng)營養(yǎng)傳輸和物質(zhì)交換，從而構(gòu)建適合細(xì)胞生長增殖的培養(yǎng)條件。動物細(xì)胞體外培養(yǎng)時，生物反應(yīng)器是整個培養(yǎng)過程的關(guān)鍵設(shè)備，為細(xì)胞提供了一個適宜的生長環(huán)境，使之快速增殖并形成所需的生物組織制品。
（三）科學(xué)研究中的類器官培養(yǎng)
1.上皮類器官研究上皮細(xì)胞-免疫細(xì)胞相互作用
上皮細(xì)胞出現(xiàn)在機(jī)體所有和外界接觸的邊界，比如皮膚，呼吸道，肺，消化道，是機(jī)體對抗病原體侵染的第一層屏障，也是第一個對病原性感染作出反應(yīng)的細(xì)胞。為了維持體內(nèi)平衡，并提供對感染的快速反應(yīng)，上皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞密切配合。
所以，在上皮區(qū)域，也是全身免疫細(xì)胞濃度最高的區(qū)域。建立上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的模型，是研究抗感染免疫和損傷后免疫的重要手段。上皮細(xì)胞類器官的建立，可以非常精準(zhǔn)的模擬機(jī)體上皮環(huán)境，也被發(fā)展起來研究上皮和免疫細(xì)胞相互作用。有三種共培養(yǎng)模式：
①用存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的重組細(xì)胞因子處理類器官，評價免疫細(xì)胞衍生細(xì)胞因子對于上皮細(xì)胞的影響。如IL-4和IL-13促進(jìn)叢生細(xì)胞分化，而IL-22支持干細(xì)胞增殖和存活。
②將器官消化到單個細(xì)胞，然后在免疫細(xì)胞存在的情況下，再生長。用于評估免疫細(xì)胞和免疫細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子(可溶性或膜結(jié)合)對器官生長和分化的影響，以及上皮細(xì)胞對免疫細(xì)胞表型的影響。
③在ECM或生長培養(yǎng)基(懸浮培養(yǎng))中，向完整類器官中添加(活化的)免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞或固有淋巴樣細(xì)胞(ILCs)，以評估免疫細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間的相互作用。這些檢測的讀數(shù)通常包含消化形成的器官和隨后的轉(zhuǎn)錄。單細(xì)胞RNA測序或定量PCR，成像和/或流式細(xì)胞術(shù)評估上皮細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞表型。在這些共培養(yǎng)中使用的免疫細(xì)胞或者直接從小鼠組織中分類，或者直接從人外周血中提取，或者先在體外分化。
圖|上皮類器官三種共培養(yǎng)模式
2.胸腺類器官研究T細(xì)胞發(fā)育
胸腺是T細(xì)胞成熟和從祖細(xì)胞向成熟的幼稚淋巴細(xì)胞分化的中心部位。來源于骨髓的T細(xì)胞祖細(xì)胞在胸腺皮質(zhì)進(jìn)行陽性選擇，隨后在胸腺髓質(zhì)中進(jìn)行陰性選擇。胸腺的這些區(qū)域由兩種不同的上皮細(xì)胞組成，皮質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞(CTECs)和髓質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞(MTECs)。
3D重建胸腺被證明是模擬其功能的關(guān)鍵，幾種胸腺類器官的產(chǎn)生方法：器官培養(yǎng)通常是從人類身上建立起來的或胎鼠或新生兒胸腺組織，但也有報道稱TEC樣細(xì)胞與人胚胎干細(xì)胞的體外分化，這些培養(yǎng)都產(chǎn)生胸腺樣結(jié)構(gòu)。
在體外產(chǎn)生活的T細(xì)胞，并在移植到裸鼠上時發(fā)揮作用。雖然長時間的類似胸腺的培養(yǎng)是可能的(離體培養(yǎng)長達(dá)56天)，但細(xì)胞在連續(xù)傳代時失去了集落形成能力。
重要的是，雖然在成年小鼠中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種雙能的TEC前體，但含cTECs和mTECs的胸腺器官尚未從單個干細(xì)胞中生成。此外，考慮到小鼠體內(nèi)某些雙能TEC前體的生長因子已被發(fā)現(xiàn)(例如BMP 4和IL-22)，可以嘗試這些因子是否可用于維持TEC的祖細(xì)胞來源的類器官。
（四）腫瘤微環(huán)境
兩種主要的方式被使用。以非小細(xì)胞肺癌為例，在整體方法中，腫瘤活檢組織是在氣液界面間環(huán)境培養(yǎng)，所有腫瘤細(xì)胞類型的細(xì)胞懸液，包括內(nèi)源性免疫細(xì)胞和其他非上皮細(xì)胞類型，促進(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞的生長。
在還原模擬方法中，上皮類器官是從腫瘤活檢組織中生長出來的，然后與來自同一患者外周血的自體免疫細(xì)胞共培養(yǎng)，以促進(jìn)腫瘤反應(yīng)細(xì)胞的連續(xù)擴(kuò)張。雖然整體方法允許包括整個腫瘤微環(huán)境的腫瘤材料的培養(yǎng)，因此與體內(nèi)情況非常相似，但不易長時間維持，而還原模擬方法允許腫瘤上皮的長期培養(yǎng)和擴(kuò)展，這使得更廣泛，更長期的研究成為可能。
（五）藥物篩選
1.促進(jìn)心肌纖維細(xì)胞生長化合物篩選
由于許多功能和生物學(xué)特性的物種差異很大，動物模型對人類心臟疾病和藥物安全性的推斷很差。人類多能干細(xì)胞(hPSC)可以為生物醫(yī)學(xué)和藥物研究提供無限的人類心肌細(xì)胞來源，有可能彌合這一鴻溝。然而傳統(tǒng)2D培養(yǎng)中的hPSC源性心肌細(xì)胞缺乏功能成熟，這在某些情況下阻礙了它們準(zhǔn)確預(yù)測人類生物學(xué)和病理生理學(xué)的能力。
多細(xì)胞3D人體類器官提供了更精確的模型，是解決這一問題的潛在方法。澳大利亞昆士蘭大學(xué)生物醫(yī)學(xué)系的科學(xué)家基于96孔板培養(yǎng)心臟心肌類器官，進(jìn)而進(jìn)行化合物篩選，從5000種化合物中篩選出不同功能化合物。
2.特定神經(jīng)類器官培養(yǎng)及藥物篩選等應(yīng)用
神經(jīng)球在不同分化培養(yǎng)基種培養(yǎng)(具體誘導(dǎo)因子及生長因子見下圖)，產(chǎn)生大腦，中腦，海馬，前腦等不同腦部類器官。
圖|神經(jīng)球在不同分化培養(yǎng)基種培養(yǎng)產(chǎn)生不同腦部類器官
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