源起研究丨免疫診斷技術(shù)原理與應(yīng)用（二）
在全球范圍內(nèi)，POCT、免疫診斷、生化診斷占據(jù)體外診斷市場的前三名，免疫診斷占比達24%。近年來我國免疫診斷產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，隨著技術(shù)的不斷進步，免疫診斷取代POCT成為我國體外診斷市場規(guī)模最大的細分市場，占據(jù)31%的市場份額，免疫診斷在我國體外診斷行業(yè)中顯得更受歡迎。眾所周知，醫(yī)療行業(yè)具有較高的壁壘，因此，源起基金深度探究醫(yī)療領(lǐng)域，開展對免疫診斷行業(yè)研究。
免疫比濁
當抗原與抗體在特殊稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)而且比例合適時，形成的可溶性免疫復(fù)合物在稀釋系統(tǒng)中的促聚劑（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當抗體濃度固定時，形成的免疫復(fù)合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也隨之增加。通過測定反應(yīng)液的濁度與一系列標準品對照，即可計算出檢樣中抗原的含量。
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圖 免疫比濁檢測原理
特點：方便、穩(wěn)定、快速（10min）；適用于常規(guī)的生化分析儀，儀器成本低；要求抗體的特異性和親和力高，抗體用量較大，檢測靈敏度偏低，抗干擾能力弱。
應(yīng)用：已知一定濃度范圍的抗原，如血漿蛋白：白蛋白（ALB）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、脂蛋白（a）、尿微量蛋白系列等；
發(fā)展：膠乳比濁：是將待測物質(zhì)相對應(yīng)的抗體包被在直徑為15－60nm的膠乳顆粒上，使抗原抗體結(jié)合物的體積增大，光通過之后，透射光和散射光的強度變化更為顯著，從而提高試驗的靈敏性。
2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）
圖 不同標記技術(shù)的發(fā)展歷史
將抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進行。將待檢樣本與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離未結(jié)合成分，加入酶標記的抗體（二抗），其與固相上的免疫復(fù)合物結(jié)合，經(jīng)洗滌，加入酶反應(yīng)底物和終止液，通過檢測體系顏色的吸光度(A)值，進行定性或定量分析。
2.3.1間接法（檢測抗體）與雙抗夾心法（檢測抗原）：
圖 間接法與夾心法檢測原理
2.3.2競爭法（檢測抗原）：
圖 競爭法檢測原理
雙抗夾心法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結(jié)合的部位，因為其一端要包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用，因此適用于分子量大的蛋白。而競爭法所測定的抗原只要有一個結(jié)合部位即可，因此對小分子抗原如一些激素和藥物等的測定常用此法。
特點：1）特異性高；2）由于使用酶標記抗原/抗體，它可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生信號放大作用，而使本法具有較高的靈敏度；3）可以進行絕對定量檢測；4）檢測步驟較多，耗時長，一般需要1-2h。
應(yīng)用：目前主要用于傳染病、寄生蟲病及其他方面的定量與定性診斷。
發(fā)展：生物素/親合素放大系統(tǒng)：
一個親合素（avidin）分子可以結(jié)合4個生物素分子（biotin），結(jié)合非常穩(wěn)定，且親合素和生物素都可與蛋白、酶、熒光素等分子結(jié)合，而不影響后者的生物活性。一個抗體分子可偶聯(lián)90個生物素分子，親合素又可以偶聯(lián)多個酶標生物素，這種多級放大作用可以進一步提高檢測體系的靈敏度。
圖 生物素/親合素放大系統(tǒng)
2.4 化學發(fā)光免疫分析
化學發(fā)光免疫分析技術(shù)包含免疫反應(yīng)和化學發(fā)光兩部分。首先將發(fā)光物質(zhì)或酶標記在抗原或抗體上，抗原或抗體與待檢測物質(zhì)特異性結(jié)合后，加入氧化劑或化學發(fā)光底物，經(jīng)氧化或與底物產(chǎn)生反應(yīng)后，化學發(fā)光物質(zhì)會形成一個處于激發(fā)態(tài)的中間體，中間體回到基態(tài)會發(fā)射光子釋放能量。由于化學檢測體系中待測物濃度與體系的化學發(fā)光強度在一定條件下呈線性定量關(guān)系的原理，利用儀器對體系化學發(fā)光強度的檢測，可以確定待測物含量。
圖 化學發(fā)光原理與分類
表：不同化學發(fā)光方法比較
特點：發(fā)光強度在4-6個量級之間，與測定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。這與酶聯(lián)免疫分析的顯色法測吸光度（OD 值）0.02-2.00的線性范圍相比，優(yōu)勢明顯。與熒光標記相比，不需要額外光源，儀器和試劑的成本降低。
應(yīng)用：目前在大多數(shù)三級醫(yī)院，化學發(fā)光已基本取代酶聯(lián)免疫成為主流，檢測范圍涵蓋腫瘤、傳染病、甲功、激素、心標、優(yōu)生優(yōu)育等各個方向。
表 化學發(fā)光免疫診斷的主要檢測項目
發(fā)展：納米磁微粒化學發(fā)光（管式發(fā)光）
圖 管式化學發(fā)光檢測過程
該技術(shù)充分利用了磁性分離技術(shù)的快速易自動化性，化學發(fā)光技術(shù)的高靈敏度性，以及免疫分析的特異性；新型納米材料如納米金、碳納米管、碳納米球、碳納米纖維以及量子點等聯(lián)用到CLIA中，大大提高了CLIA的信號強度和穩(wěn)定性。
目前管式化學發(fā)光技術(shù)應(yīng)用比較成熟，因首個樣本出結(jié)果快，支持急診插入樣本，極大地滿足了臨床檢測需求，已經(jīng)在大部分定量檢測項目上對放射免疫分析技術(shù)和酶聯(lián)免疫分析技術(shù)形成替代，成為免疫診斷市場上的主流技術(shù)產(chǎn)品。
管式化學發(fā)光儀器與試劑需配套使用，形成封閉系統(tǒng)，為廠家提供了更寬的護城河。但不同廠家的檢測結(jié)果往往不具有可比性，不管是國產(chǎn)與進口廠家之間、進口與進口廠家之間都是如此，原因是抗原表位、干擾物質(zhì)、儀器構(gòu)造、試劑性能等各不相同。
2.5 免疫層析
指將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合。若用膠體金標記抗體，抗原與抗體的結(jié)合會導致膠體金積聚，因為其本身為紅色，使得該區(qū)域顯示一定深度的顏色，通過眼睛觀察就可以獲得定性的結(jié)果。使用CCD相機對顯色圖片進行灰度量化分析，可以得到相對定量（半定量）結(jié)果。
圖 免疫層析（膠體金法）原理
特點：操作簡便、快速，不需特殊儀器與其他實驗設(shè)備；
應(yīng)用：早孕、心梗、傳染病、藥品、毒品等檢測。主要用于即時檢驗與居家檢驗。
發(fā)展：時間分辨熒光免疫層析
當將含有待測抗原（抗體）的樣品滴在加樣區(qū)，待測樣品中的抗原（抗體）與結(jié)合墊中的鑭系元素離子螯合物熒光納米微球標記的抗體（抗原）結(jié)合并通過毛細作用向前層析，當達到檢測區(qū)后，與檢測線上固定的抗體（抗原）結(jié)合，形成微粒-抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合物并被固定在檢測線上，而多余的熒光微球標記物繼續(xù)向前層析，與固定在質(zhì)控線二抗結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，用紫外光源（340nm）對檢測區(qū)掃描檢測，檢測線和質(zhì)控線上熒光納米微球發(fā)出高強度的熒光（615nm），且衰變時間也較長。利用延緩測量時間，待樣品基質(zhì)中自然發(fā)生的短壽命熒光（1-10ns）全部衰變后，再測量稀土元素的特異性熒光（10-1000us），這樣就可以完全排除特異本底熒光的干擾。通過檢測線和質(zhì)控線熒光強度的強弱及其比值，即可對樣品中待測物進行相對定量（半定量）檢測。
圖 時間分辨熒光免疫層析原理
圖 時間分辨熒光檢測原理
3.免疫診斷技術(shù)發(fā)展趨勢
根據(jù)我國臨床診斷市場兩極化特點，我們認為免疫診斷技術(shù)有兩個發(fā)展趨勢值得重視。
3.1大醫(yī)院檢驗科提效：高度自動化的多聯(lián)檢驗技術(shù)
代表：流式熒光技術(shù)（液相芯片）
以熒光編碼微球為核心（Luminex公司專利），集流式原理、熒光分析、高速數(shù)字信號處理等多種技術(shù)于一體，具有高通量、高靈敏度、重復(fù)性好等特點；可用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、受體、配體識別分析等多領(lǐng)域的研究。
圖 流式熒光技術(shù)原理
1）高通量：一次可同時檢測2-500種生理病理指標，這與傳統(tǒng)方法的逐個指標檢測相比，是質(zhì)的飛躍。
2）所需樣本量少：僅需10μl,可做多個指標檢測。
3）速度快：最快9600T/h，化學發(fā)光為600T/h。
4）重復(fù)性好：可以抽取其中的100顆微球讀數(shù)，最終的數(shù)據(jù)取其均值或中位值，這樣可將誤差減到最小。
5）高敏感性和線性范圍寬，與進口化學發(fā)光相當。
6）對儀器要求高，單個項目的試劑成本低。
應(yīng)用：HLA配型、自身免疫病檢測、過敏原檢測、腫瘤標志物檢測、基因突變檢測、HPV分型等眾多免疫、分子檢測。
3.2 分級診療帶來的多場景應(yīng)用：小型智能化診斷技術(shù)
3.2.1 微流控芯片（固相芯片）
微流控芯片采用類似半導體的微機電加工技術(shù)在芯片上構(gòu)建微流路系統(tǒng)，將實驗與分析過程轉(zhuǎn)載到由彼此聯(lián)系的路徑和液相小室組成的芯片結(jié)構(gòu)上，加載生物樣品和反應(yīng)液后，采用微機械泵。電水力泵和電滲流等方法驅(qū)動芯片中緩沖液的流動，形成微流路，于芯片上進行一種或連續(xù)多種的反應(yīng)。
圖 微流控芯片原理
特點：高通量、所需樣本少；操作簡便、不需額外耗材、對儀器要求低；封閉式設(shè)計可防止對環(huán)境的污染。但其對復(fù)雜樣本分析較為困難；由于空間小，液流量小，因此檢測靈敏度和精密度相對較差。
應(yīng)用：適合高濃度的多指標快速檢測，及避免污染的分子檢測領(lǐng)域。
3.2.2 POCT
即時檢驗（point-of-care testing），指在病人旁邊進行的臨床檢測及床邊檢測，通常不一定是臨床檢驗師來進行。根據(jù)中國醫(yī)學裝備協(xié)會POCT 裝備技術(shù)專業(yè)委員會的定義，是指采樣現(xiàn)場進行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到檢測結(jié)果的一種檢測方式。
POCT主要應(yīng)用的技術(shù)包括干化學技術(shù)、免疫層析技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、免疫比濁技術(shù)、微流控技術(shù)、生物傳感器技術(shù)，測試對象也由生化指標、免疫指標逐步外延到核酸指標。
生物傳感器：偶聯(lián)一個特定的生物檢測器（如酶、抗體或核酸探針）到一個換能器用于靶分析物的直接測定而無需從基質(zhì)中分離它。商業(yè)的POCT儀器用電化學技術(shù)（如微型離子選擇電極）和光學生物傳感器去測定葡萄糖，電解質(zhì)（K+、Na+、Cl-等）和血氣（PH、PCO2、PO2等）。隨著抗體固定技術(shù)和特異DNA序列的應(yīng)用，生物傳感器探針將很快用于檢測激素、藥物、難于培養(yǎng)的細菌、病毒等。
特點：
1）儀器小型化、一體化；不需額人工處理；
2）檢測快速：30min內(nèi)；
3）能夠節(jié)約綜合成本（場地、人力等）；
4）對試劑穩(wěn)定性要求高、對精密度要求相對較低
5）定性與半定量檢測為主。
應(yīng)用：海關(guān)、學校、戰(zhàn)爭、重大自然災(zāi)害、重大疫情等現(xiàn)場應(yīng)用場景；在心臟標志物、凝血、血氣、傳染病、毒品、血糖等檢測領(lǐng)域具有應(yīng)用優(yōu)勢。
4.總結(jié)
本報告主要介紹了以下免疫診斷技術(shù)的原理與應(yīng)用：
1）免疫學診斷的基本概念與物質(zhì)基礎(chǔ)：抗原、抗原決定簇、抗體、制備；抗原與抗體結(jié)合特點（特異性、可逆性、比例性）；體外診斷試劑評估指標（檢測限、檢測靈敏度、特異性）；
2）免疫診斷技術(shù)原理與應(yīng)用：免疫組化（免疫熒光）、免疫比濁（膠乳比濁）、免疫層析（時間分辨熒光免疫層析）、 酶聯(lián)免疫吸附（間接法、雙抗夾心法、競爭法、生物素/親和素放大系統(tǒng)）、化學發(fā)光（管式發(fā)光）。
3）免疫診斷技術(shù)發(fā)展趨勢：流式熒光技術(shù)、微流控芯片技術(shù)、POCT。
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